在过去二十多年中，光学显微成像技术发展迅速，不断突破传统极限。生命科学研究要求成像系统在不影响生物活性的前提下，实现更大视野、更高分辨率、更高速度的三维成像。这意味着对成像探测器——科研相机的要求也越来越高。从本周开始，我们将带来前沿显微成像技术专题系列，探讨前沿显微成像技术以及对科研相机的相关性能要求。首期我们将关注近年来广受关注和发展的光片荧光显微镜（Light Sheet Fluorescence Microscopy）。

光片荧光显微镜的诞生

传统的宽场荧光显微镜通过物镜将激发光聚焦，同时收集样品的荧光信号成像。这种照明方式会导致焦平面以外的样品也被照亮，带来一系列局限性，如引入额外光毒性、影响样品生物活性，甚至造成细胞死亡；成像焦平面以外的干扰信号进入图像，导致图像分辨率和反差降低。

激光扫描共聚焦显微镜使用点扫描方法，通过在探测端引入针孔，滤除了焦平面以外的杂散光，提升了分辨率，特别是Z轴方向的分辨率，实现了三维成像。然而，它仍然存在光漂白和光毒性问题，且成像速度相对较慢。

1990年发明的双光子激光扫描显微镜通过使用近红外激光照明，降低了光毒性，并能穿透更深样品。但由于双光子信号的弱点和缓慢的采集速度，它不适合对大样品进行动态成像。

光片荧光显微镜的优点

光片荧光显微镜的照明光是一张与成像面平行的薄薄的光片，只有焦平面上的样品被照亮，而上下的样品不受影响。这种照明方式提高了图像和背景的反差（Signal-to-Background Ratio）和轴向分辨率，减少了光漂白和光毒性，使得在更接近生理状态的条件下，对活体生物样品进行长时间的三维成像成为可能。此外，光片显微镜使用高量子效率的CCD或sCMOS相机进行面成像，大大提高了成像速度和图像的信噪比。

在多数光片系统中，光学元件是固定的，需要移动样品 (或使光片从xyz方向扫过样品) 来获得完整的3D图像。通过移动或旋转样品，可以对大样品进行成像，并从多个角度拍摄，将这些多视角图像通过特别算法融合在一起后，能够进一步提高图像分辨率，并修正一些光片技术特有的缺陷。

总之，光片荧光显微镜从设计原理上，大大降低了激发光对活体样品的光毒性和光漂白，天生具有光学切片能力，使用高量子效率的CCD或sCMOS探测器，是大视野，高速，高分辨率三维活体显微成像的理想工具。

“光片”的实现

产生光片最简单的方法是在光路中引入一个圆柱形透镜。通过该透镜的光，宽度维持不变，但在高度上被压缩成平面 (图4)，然后通过照明物镜，在焦面上形成“光片”。成像物镜垂直于照明物镜放置，并聚焦在光片上获取荧光信号。

图4 圆柱形透镜 (Edmund光学)

使用这种方法生成的光片，其宽度和厚度由照明物镜的NA值决定。如图5所示，照明光束的实际形状是一个两头宽，中间细的“沙漏”形。ω0为光束腰厚度，也就是光片厚度，b为均匀照明宽度，也就是有效视野。

图5 光片特性（箭头指示激发光束的方向）

有如下公式：

因此，使用NA较小的照明物镜，能够实现较宽范围的均匀照明，即视野更大；但是相应的，光片的厚度也越大，导致轴向分辨率降低。而高NA物镜产生的光片视野会比较小，但轴向分辨率较好。

要注意的是，如果成像物镜的NA值很高，使得其景深小于光片的厚度，那么系统的轴向分辨率主要是由成像物镜的景深决定。但这时会产生普通荧光照明时具有的问题，即焦面上下的部分样品会被照亮，不必要的光毒性和杂散光会对成像效果产生负面影响。
如果成像物镜的NA值较低，光片厚度比它的景深要小，那么系统的轴向分辨率就由光片的厚薄来决定。